Abstract

L’epilettogenesi è il processo graduale mediante il quale il cervello sano sviluppa l’epilessia. Tuttavia, i cambiamenti del circuito neuronale che stanno alla base dell’epilettogenesi non sono ben compresi. Sfortunatamente, i modelli attuali di epilessia indotta dal punto di vista chimico o elettrico soffrono di carenza di specificità cellulare, quindi è raramente noto quali cellule siano state attivate durante l’epilettogenesi. Abbiamo quindi cercato di sviluppare una variante optogenetica del classico modello di epilessia in cui le cellule attivabili sono definite geneticamente e marcate in modo fluorescente. Abbiamo brevemente attivato le cellule piramidali (PC) attivate optogeneticamente in topi che si comportano da sveglio ogni due giorni e condotto una serie di esperimenti per convalidare l’efficacia del modello. Sebbene inizialmente inerti, i brevi stimoli optogenetici alla fine hanno suscitato convulsioni che sono aumentate in numero e gravità con ulteriori sessioni di stimolazione. Le convulsioni erano associate a plasticità di lunga durata, ma non a danno tissutale o reattività degli astrociti. Una volta optokindled, i topi hanno mantenuto un’elevata suscettibilità alle crisi per diverse settimane in assenza di stimolazione aggiuntiva, indicando una forma di sensibilizzazione a lungo termine. Concludiamo che optokindling condivide molte caratteristiche con l’accensione classica, con l’ulteriore vantaggio che il ruolo di specifiche popolazioni neuronali nell’epilettogenesi può essere studiato. I collegamenti tra plasticità a lungo termine ed epilessia possono quindi essere chiariti.

Introduzione

Nel 1967 Graham Goddard pubblicò il suo autorevole articolo1 sul modello di attivazione dell’epilessia, in cui descriveva come una breve stimolazione elettrica ad alta frequenza giornaliera di specifiche aree sub-corticali del cervello portava alla fine a crisi comportamentali in un sottogruppo di animali altrimenti sani e non epilettici . Poiché gli animali accesi mantenevano una soglia ridotta per i sequestri a lungo termine, Goddard sosteneva che il processo era “analogo all’apprendimento” 1, come proposto da Donald Hebb2 e altri3, suggerendo che l’epilessia potrebbe derivare da modelli di attività patologici che reclutano meccanismi di apprendimento nel cervello sano4. Benché non rappresenti ugualmente tutte le forme di epilessia5, il modello di kindling classico è oggi ampiamente accettato come un modello di epilessia funzionale in cui l’attività patologica evocata si sviluppa gradualmente in cervelli altrimenti sani6.

Tuttavia, il modello originale di kindling soffre di una serie di problemi chiave. Ad esempio, è stato difficile districare il contributo del danno tissutale dai meccanismi di plasticità7. Inoltre, lo sperimentatore non può controllare prontamente il sottoinsieme di cellule che vengono attivate con l’accensione classica, rendendo difficile stabilire i nessi causali tra il tipo di cellula e l’esito patologico. Questa mancanza di specificità può a sua volta contribuire a risultati meno standardizzati nei vari laboratori.

Per migliorare queste carenze, abbiamo sviluppato un metodo di accensione optogenetico. Optokindling ha condiviso diverse caratteristiche chiave con il modello classico di epilessia1,4: (1) la stimolazione ripetuta, mentre inizialmente inefficace, alla fine ha provocato convulsioni elettrogafiche e comportamentali; (2) la gravità e la durata di questi attacchi sono aumentate nel tempo; e infine, (3) gli animali con convulsioni che sono stati lasciati non stimolati per un periodo prolungato mostravano la ritenzione del potenziale convulsivo quando la stimolazione riprendeva. Inoltre, optokindling era robusto e non causava danni cerebrali apprezzabili o reattività gliale. Poiché il gruppo di cellule otticamente guidato è definito geneticamente e marcato in modo fluorescente nel nostro modello, consente lo studio di cambiamenti di cellule e circuiti associati all’epilettogenesi.

Risultati

Stabilire un approccio di accensione optogenetica
Per creare una variante optogenetica del classico modello di epilessia di kindling di Goddard1, abbiamo espresso la variante E123T / T159C Channelrhodopsin-2 (ChR2) ad alta efficienza8 nei PC M1 usando il promotore CaMKIIα, mediante iniezione stereotassica bilaterale del virus adeno-associato (AAV) in topi maschi P30-45 C57BL / 6 (vedi metodi). Abbiamo verificato l’espressione di ChR2 mediante microscopia a scansione laser a 2 fotoni (2PLSM) del tag EYFP. Questo ha rivelato l’espressione densa nello strato 2/3 (L2 / 3), l’espressione sparsa in L5 e L6 e nessuna etichetta apprezzabile in L1 o sostanza bianca (Figura 1A), coerente con i modelli di espressione pubblicati del promotore CaMKIIα9.

Optokindling tramite registrazione EEG simultanea e stimolazione ChR2 in animali che si comportano da sveglio. (A) La sezione M1 della coronale immunocolorata per EYFP indicava l’espressione di ChR2 in L2 / 3, 5 e 6, sebbene prevalentemente in L2 / 3. L’inserto mostra il primo piano dei PC L2 / 3 che esprimono ChR2. (B) Per attivare simultaneamente ChR2 e acquisire EEG, le ferrule e le viti di registrazione sono state impiantate bilateralmente sopra M1, senza penetrare nella corteccia. I cavi in fibra ottica erano accoppiati ad aria a laser da 445 nm. I segnali EEG sono stati elaborati da un amplificatore extracellulare, ma non pre-amplificati. Un computer (non mostrato) TTL-gated i laser e i segnali EEG amplificati digitalizzati. (C) In ogni sessione di stimolazione, M1 è stato acceso (durante “Induzione”) con 15 attacchi di 3 secondi di 50 secondi di impulsi laser da 5-ms 445 nm, suddivisi in tre sweep consegnati una volta al minuto. Le sessioni sono state ripetute almeno 25 volte ogni due giorni. In questa sessione di esempio di un animale non ingenuo, un primo attacco elettrografico è stato evocato nel primo colpo di induzione. Le risposte EEG agli stimoli laser a impulsi accoppiati a 30 Hz sono state registrate per 10 minuti prima e 20 minuti dopo l’induzione di accensione. I dati sono rappresentati come media ± SEM qui e in tutto il manoscritto se non diversamente specificato. Inserto: Le risposte EEG a impulsi accoppiati prima (rosso) e dopo (blu) indicavano una variazione della dinamica EEG ma non l’ampiezza.

Eravamo preoccupati che la luce laser a 445 nm non potesse penetrare nell’intero spessore corticale, portando forse a un accensione inefficiente o imprevedibile. Per indagare se la luce è stata consegnata a strati subgranulari in quantità sufficienti per attivare ChR2, abbiamo misurato la trasmissione della luce attraverso il tessuto neocorticale ex vivo (vedi Metodi). Abbiamo trovato che il profilo di penetrazione era coerente con i rapporti precedenti10 (Figura complementare S1). Come regola generale, l’intensità della luce deve raggiungere> 1 mW / mm2 per garantire l’attivazione di una soglia superiore11. Con due laser da 120-mW e perdita di potenza attraverso il cavo in fibra ottica misurato in genere a <50% (dati non mostrati), abbiamo usato questo profilo (figura supplementare S1) per stimare ~ 8 mW / mm2 a L6 / sostanza bianca limite, ben al di sopra del limite di intensità per l’attivazione di suprathreshold. Inoltre, notiamo che la maggior parte dei PC che esprimono ChR2 erano più vicini alla superficie del pial (Fig. 1), offrendo così un notevole margine di sicurezza.

Successivamente abbiamo voluto verificare che potremmo guidare neuroni neocorticali a frequenze sufficienti per l’accensione12. Per fare ciò, abbiamo usato registrazioni di cellule intere in sezioni acute (vedi Metodi Supplementari) per esplorare la dinamica di frequenza della variante E123T / T159C ChR2 ad alta efficienza8 che abbiamo usato. Abbiamo scoperto che i PC L5 registrati seguivano treni a impulsi di luce a 50 Hz con fedeltà del 90% (Figura complementare S2), che dovrebbe essere più che sufficiente per legare PC neocorticali insieme con il potenziamento a lungo termine (LTP) 13 e per il kindling12. Presi insieme (Fichi Supplementari S1 e S2), i nostri risultati hanno stabilito che dovrebbe essere possibile sostituire optogenetic per la stimolazione elettrica nel modello di attivazione dell’epilessia.

Il kindling classico e optogenetico condivide alcune caratteristiche distintive
Successivamente abbiamo acceso gli animali ogni due giorni con un breve paradigma di stimolazione laser (Figura 1C). Per quantificare l’epilettogenesi, abbiamo registrato l’EEG con elettrodi a vite con impianto bilaterale (Fig. 1B) e il comportamento con due telecamere, una posizionata sopra l’animale (vedere Film supplementari 1 e 2) e una a lato. Ispirati dai classici esperimenti LTP in vitro13,14, abbiamo anche registrato le risposte di base EEG prima e dopo l’accensione (Figura 1C). Questo ci ha permesso di cercare cambiamenti a lungo termine nell’ampiezza e nella dinamica temporale delle risposte EEG (Figura 1C, vedi anche sotto e Fig. 5).

Optokindling e l’accensione classica condividono caratteristiche di sequestro tipico. (A) Optokindling richiedeva sia la stimolazione laser che l’espressione di ChR2. Il numero di animali che esprimono ChR2 stimolati che hanno sviluppato convulsioni elettrografiche (9 su 12 animali) è stato maggiore rispetto ai controlli ChR2 non stimolati (0 su 4) e ha stimolato i controlli no-ChR2 (0 su 5) (test esatto di Fisher, p = 0,001). (B) La gravità del sequestro comportamentale, misurata da un punteggio Racine modificato17, è aumentata rispetto alle sessioni (test di correlazione di rango di Spearman, rho = 0,957, p <0,001, n = 12 animali). (C) Un numero crescente di crisi elettrografiche sviluppate negli animali che esprimono ChR2 stimolati (test di correlazione di rango di Spearman, rho = 0,862, p <0,001, n = 30 convulsioni da 9 animali). (D) Una volta che si sono manifestate crisi convulsive, la durata delle crisi è aumentata gradualmente durante le sessioni (r = 0,674, p <0,001, n = 30 convulsioni da 9 animali). I cerchi aperti rappresentano le convulsioni individuali, mentre i cerchi chiusi sono le medie rispetto a una sessione prima e dopo. Le misure lineari sono fatte per l’intero set di dati. (E) La soglia delle convulsioni, misurata come tempo di insorgenza di crisi elettrografiche dall’inizio dell’induzione, è diminuita tra le sessioni (r = -0,478, p = 0,008, n = 30 convulsioni da 9 animali, simboli come in D). Le caselle grigie indicano le tre epoche di induzione a 50 Hz. Sono stati adattati adattamenti lineari ai singoli punti di dati, non ai dati associati.

Gli animali accesi hanno mantenuto un aumento a lungo termine della suscettibilità alle crisi. (A) i topi riaccesi hanno avuto attacchi comportamentali più gravi rispetto agli animali naïve (test di Kruskal-Wallis, p <0,001, n = 5 animali riaccesi, n = 5 animali naïve). I punteggi Racine delle otto sessioni di riaccensione (blu) sono stati confrontati con le prime otto sessioni in animali naïve (rosso). (B) Gli animali riaccesi (“rek”) hanno avuto attacchi comportamentali più gravi rispetto agli animali naïve (“parentela”; t test t di Student, p = 0,009, n = 5 animali). (C) Le convulsioni elettrografiche in animali riaccesi si sono verificate in sessioni precedenti rispetto a topi naïve (U-183,5 di Mann-Whitney, p <0,001, n = 4 animali). (D) Le crisi elettrografiche in topi riaccesi si sono verificate dopo un numero inferiore di sessioni rispetto agli animali naïve (test t abbinato dello studente, p = 0,003, n = 4 animali). (E) La durata della crisi elettrografica era indistinguibile tra animali accesi e riaccesi (test t abbinato dello studente, p = 0,43, n = 4 animali). (F) La soglia convulsiva, misurata dal tempo per l’insorgenza di crisi elettrografiche dopo l’inizio della stimolazione della luce (vedi Fig. 1C), non era diversa nei topi accesi e riaccesi (t test di Student, p = 0,86, n = 4 animali) .

L’immunoistologia non ha rivelato alcuna reattività astrocitica o perdita neuronale. (A) Campione di fette coronali da un animale con apertura optogeneticamente macchiato per EYFP per etichettare le cellule che esprimono ChR2 (“ChR2”), GFAP per etichettare per la reattività astrocitica (“GFAP”) e NeuN per valutare i conteggi del corpo cellulare neuronale (“NeuN” ). (B) La reattività astrocitica, come indicato dall’espressione GFAP sovraregolata, era indistinguibile tra animali con crisi evocate (“stimolo ChR2”, n = 59 sezioni) e i due gruppi di controllo (“no stim ChR2”, n = 42; “stim no ChR2 “, n = 19, ANOVA a una via, p = 0,11). (C) La densità delle cellule neuronali non differiva tra le tre coorti animali (“stimolo ChR2”, n = 23, “nessuno stim ChR2”, n = 14 e “stim no ChR2”, n = 13, ANOVA a una via, p = 0,10; confrontare la figura 2A).

Le risposte EEG evocate hanno mostrato plasticità a lungo termine. (A) Esempio di prime e seconde risposte EEG dovute alla stimolazione laser a impulsi accoppiati mediata durante i periodi di riferimento prima e dopo l’induzione in una sessione. (B) L’ampiezza della risposta EEG dell’ensemble mediata in tutte le sessioni in un animale ha mostrato un potenziamento entro la sessione del secondo ma non la prima risposta. (C) L’entità della plasticità della prima risposta EEG è rimasta inalterata tra sessioni e animali (sinistra, p = 0,32, n = 9 stimoli animali ChR2 vs n = 4 animali stimoli ChR2, test di Friedman). La prima risposta della linea di base pre-induzione è rimasta alla stessa ampiezza tra le sessioni e gli animali (a destra, risposte normalizzate alle prime due sessioni indicate da linee tratteggiate verticali, p = 0.99, stimolo ChR2 vs. nessuno stim ChR2, test di Friedman). Rosso: stim ChR2, grigio: senza stim ChR2. (D) L’entità della plasticità della seconda risposta EEG è rimasta elevata tra le sessioni e gli animali (a sinistra, p <0,001, stimolo ChR2 rispetto a nessuno stimolo ChR2, test di Friedman), sebbene calato nelle prime cinque sedute. La seconda risposta della linea di base pre-induzione è rimasta potenziata attraverso sessioni e animali (a destra, normalizzata come in C, p <0,001, stimola ChR2 senza stimolo ChR2, test di Friedman), sebbene sembrasse saturarsi, forse con il diminuire della plasticità (a sinistra). Blu: stim ChR2, grigio: senza stim ChR2.

Le convulsioni evocate erano piuttosto evidenti, sia dal punto di vista comportamentale che da quello elettrografico (Supplementary Movie 2 e Fig. 1C). Per eliminare le distorsioni dello sperimentatore associate al punteggio manuale, le convulsioni elettrografiche sono sempre state rilevate automaticamente dagli sweep EEG utilizzando un semplice algoritmo software interno (figura complementare S3). In breve, l’energia spettrale EEG è stata convertita in z-score e gli eventi che superano una soglia z-score determinata dal rumore di base per almeno quattro secondi sono stati automaticamente classificati come crisi elettrografiche (vedi Metodi Supplementari). Proprietà come i numeri di crisi e la durata delle convulsioni sono state valutate utilizzando questa analisi automatizzata. Il nostro software personalizzato ha anche permesso l’ispezione visiva scomposendo i segnali EEG in diverse bande di frequenza (figura supplementare S3). Usando il nostro rilevamento automatico delle crisi elettrostatiche in combinazione con il nostro approccio optoindicatore, abbiamo ottenuto convulsioni evocate in 9 su 12 animali (Figura 2A). Come per il classico accendino elettrico4 (a meno che non sia stato sovraccaricato per lunghi periodi15,16), non abbiamo mai riscontrato crisi elettrografiche spontanee, basate su un totale di 125 ore di registrazione EEG.

Per verificare che le convulsioni evocate fossero specifiche sia per la stimolazione laser sia per l’espressione di ChR2, abbiamo effettuato due esperimenti di controllo. Innanzitutto, abbiamo iniettato topi con AAV che portava ChR2 come prima, ma omissione di 50 Hz è stata omessa (Figura 2A). In secondo luogo, abbiamo iniettato topi con AAV che trasportavano EYFP ma senza ChR2, e hanno effettuato l’induzione come prima (Figura 2A). Come previsto, non sono state rilevate crisi elettrografiche in nessuno dei due gruppi di controllo (figura 2A). Questi esperimenti di controllo hanno inoltre verificato la specificità del nostro algoritmo di rilevamento automatico delle crisi (Supplementary Fig. S3).

Abbiamo poi esplorato se optokindling ha condiviso proprietà con il kindling classico1. Usando una versione modificata della scala di Racine17 (Tabella 1) per valutare il comportamento durante il periodo di induzione di 3 minuti (vedi Metodi e Fig. 1C), abbiamo rilevato che la gravità è aumentata rispetto alle sessioni (Figura 2B). Nelle sedute iniziali, le crisi elettrografiche non sono state rilevate, ma sono emerse gradualmente dopo diverse sessioni (Figura 2C). Con ogni sessione che è passata, le convulsioni elettrografiche rilevate aumentavano di durata e venivano indotte dopo periodi più brevi di stimolazione luminosa (Figura 2C, D). Da quando abbiamo interrotto la stimolazione prima che i punteggi di Racine si stabilizzassero, non era chiaro che la gravità del sequestro comportamentale fosse saturata nei nostri esperimenti. Ciononostante, il nostro approccio optoindicatore ha così condiviso diverse caratteristiche distintive con la sua controparte classica4, compresa un’emergenza graduale in combinazione con un aumento della gravità e della durata delle crisi, nonché una soglia di crisi ridotta.

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È stato riferito che la suscettibilità delle crisi ha una dipendenza circadiana18, che colpisce in modo preferenziale durante l’inattività rispetto al ciclo luce-buio. Non abbiamo trovato alcuna correlazione tra l’incidenza delle crisi evocate e il tempo circadiano, o tra la durata della crisi elettrografica e il tempo circadiano (Figura complementare S4). Tuttavia, abbiamo trovato una debole correlazione tra il tempo di crisi elettrografica e il tempo circadiano (Figura complementare S4), coerente con una soglia di crisi abbassata durante la notte18.

Topi con attivazione optogenetica mantengono una suscettibilità a lungo termine alle convulsioni
Una caratteristica chiave del modello originale di Goddard era che gli animali accesi mantenevano una soglia ridotta per le convulsioni a lungo termine, che interpretava come una forma di memoria1. Abbiamo verificato se questo fosse vero anche per il nostro metodo optokindling. Dopo il successo dell’accensione in un sottogruppo di animali, abbiamo interrotto la stimolazione per 36 giorni. Abbiamo quindi reiniziato la stimolazione per un secondo periodo di riaccensione negli stessi animali. Abbiamo confrontato a coppie gli animali riaccesi con i loro sé ingenui e accesi.

Abbiamo scoperto che le convulsioni provocate nelle sessioni riaccese erano comportamentalmente più gravi rispetto alle sessioni accese (Figura 3A, B) e si sono verificate anche dopo un minor numero di sessioni di stimolazione (Figura 3C, D). Tuttavia, la durata e la soglia di crisi elettrografica non sono cambiate dopo il riaccendersi rispetto ai topi accesi (Fig. 3E, F). Poiché questi esperimenti a più lungo termine erano inclini al fallimento, il numero di animali è inferiore, il che significa che la potenza statistica è relativamente ridotta. Con questo avvertimento, i nostri risultati hanno supportato l’opinione secondo cui gli animali attivati optogeneticamente mantenevano una soglia ridotta per i sequestri a lungo termine, come precedentemente riportato per il classico accenno1,4,6.

Le convulsioni si sono sviluppate in assenza di danni cerebrali grossolani e reattività gliale
I modelli di convulsioni indotte possono essere associati a lesioni, che sono state collegate a tassi di crisi più elevati19. Il contributo dell’attività patologica e della plasticità all’epilettogenesi può quindi essere difficile da districare da quello della lesione. Per valutare la quantità di lesione tessutale nella nostra optokindling prodotta, abbiamo cercato astrociti reattivi e perdita cellulare usando la colorazione GFAP e NeuN, rispettivamente (vedi Metodi Supplementari e Fig. 4). Per visualizzare la regione delle cellule che esprimono ChR2, abbiamo colorato per EYFP. Abbiamo confrontato tre categorie di animali: animali optogeneticamente accesi, animali che esprimono ChR2 non accesi e animali stimolati dal laser che non esprimevano ChR2 (le stesse tre coorti come in Fig. 2A). Nel confrontare questi tre gruppi, non siamo stati in grado di rilevare alcuna differenza nell’immunoreattività GFAP o nella conta delle cellule neuronali (Figura 4). In conclusione, l’attività patologica piuttosto che la lesione, come indicato dalla reattività degli astrociti e dalla perdita delle cellule neuronali, è stato l’agente causale chiave nel nostro modello di epilessia optogenetica.

L’epilettogenesi è associata a cambiamenti a lungo termine della dinamica EEG
Poiché la plasticità di Hebbian è intrinsecamente instabile20, abbiamo ipotizzato che l’epilettogenesi potesse essere guidata dalla plasticità hebbiana2. In tal caso, le risposte EEG evocate con la luce laser dovrebbero subire un rafforzamento duraturo dopo optoindicazioni4,6. Per indagare se ci fossero cambiamenti associati alla stimolazione di induzione ad alta frequenza, abbiamo confrontato le risposte EEG durante i periodi di riferimento dopo e prima dell’induzione (vedi Fig. 1C). Per vedere se ci sono stati cambiamenti di lunga durata che sono stati mantenuti più a lungo della distanza di due giorni delle sessioni, abbiamo esplorato le risposte EEG durante il periodo di riferimento della pre-induzione e le abbiamo confrontate in tutte le sessioni.

Abbiamo scoperto che la prima risposta EEG dovuta a uno stimolo laser a impulsi accoppiati non era potenziata (Figura 5A-C), in disaccordo con la nostra ipotesi che la plasticità classica hebbiana potrebbe essere alla base dell’epilettogenesi nel nostro modello optokindling. La seconda risposta EEG, tuttavia, è stata straordinariamente potenziata all’interno di ciascuna sessione (Figura 5B), come riportato in precedenza per il trattamento ippocampale21. La quantità di potenziamento della seconda risposta calava gradualmente tra le sessioni poiché l’ampiezza apparentemente saturata (figura 5D). Questo potenziamento non era dovuto all’alterazione dello sviluppo nella dinamica a breve termine precedentemente riscontrata nella necortex giovanile22, poiché era assente negli animali di controllo che esprimono ChR2 che non erano accesi (tracce grigie in Fig. 5).

I nostri risultati indicavano che, sebbene esistesse una plasticità a lungo termine delle risposte EEG evocate dal laser, questo probabilmente non corrispondeva alla plasticità Hebbiana, dal momento che la seconda, ma non la prima risposta dovuta a uno stimolo a impulsi accoppiati, era potenziata. Forse alterazioni a lungo termine della dinamica EEG erano dovute a cambiamenti nella plasticità sinaptica a breve termine. Un’altra possibilità che non si escludono a vicenda è una riduzione del comando inibitorio, come suggerito in precedenza21.

Le proprietà cellulari intrinseche non erano influenzate dall’accensione
Ripetute sparatorie ad alta frequenza possono alterare l’eccitabilità dei PC neocorticali23. Ci siamo pertanto chiesti se l’optoindirizzamento abbia dato origine a cambiamenti nelle proprietà neuronali intrinseche come la soglia degli spike, la resistenza di input o il potenziale di membrana a riposo. Per esplorare questa possibilità, abbiamo registrato a fette acustiche le risposte spiking dei PC L2 / 3 per aumentare gradualmente le iniezioni correnti (Figura complementare S5). Abbiamo trovato, tuttavia, che nessuna delle proprietà cellulari intrinseche che abbiamo studiato è stata influenzata dalla ripetuta stimolazione ad alta frequenza dell’optokindling (Figura complementare S5).

Picchi di potenza ad alta frequenza prima della potenza a bassa frequenza nelle crisi evocate
È stato precedentemente riportato che le oscillazioni ad alta frequenza spesso precedono l’insorgenza di crisi elettrocardiografiche neocorticali24. L’ispezione visiva delle crisi ha indicato che questo potrebbe essere il caso nel nostro modello (Figure 1C e 6A-C; Figura supplementare S3A, C, D). In tal caso, il picco di frequenza delta nelle crisi dovrebbe essere preceduto da un picco nella gamma di ripple ad alta frequenza (Fig. 6C). Infatti, abbiamo scoperto che la potenza ad alta frequenza ha raggiunto il picco più di sei secondi prima della potenza a bassa frequenza (Fig. 6D).

Le oscillazioni ad alta frequenza raggiungono il picco prima delle oscillazioni a bassa frequenza. (A) Esempio di tracciamento EEG che illustra un attacco elettrografico evocato optogeneticamente, con inizio e fine convulsivi rilevati automaticamente indicati da linee tratteggiate verticali (vedere Metodi e figura supplementare S3). Si noti che il sequestro inizia con oscillazioni rapide e termina con oscillazioni lente. I periodi di stimolazione della luce laser sono indicati in blu (Fig. 1C e figura complementare S3). (B) Trasformatore di Wigner di crisi elettrografica in (A) che mostra decadimento graduale in componenti ad alta frequenza, nonché un aumento graduale della potenza a bassa frequenza. (C) Tracce Z-score di potenza FFT per bande delta (rosse, 4-8 Hz) e ripple (blu, 80-250 Hz) derivate dalla traccia EEG in (A) mostrano come il picco delle oscillazioni ad alta frequenza (freccia blu) prima delle loro controparti a bassa frequenza (freccia rossa). (D) La potenza di picco delle alte frequenze si è verificata prima rispetto a quella delle basse frequenze (6,4 ± 1 sec, n = 51 convulsioni da 9 animali, p <0,001, t test per differenza di media rispetto al tempo zero). I punti dati indicano la differenza tra i picchi di frequenza bassa e alta per le crisi individuali. Il grafico a riquadri mostra il primo quartile, la mediana e il terzo quartile con baffi che denotano una deviazione standard dalla media.

La depressione post-operatoria del potere EEG segue crisi epilettiche indotte da optogeneticamente
Studi precedenti hanno rivelato che il potere EEG è spesso temporaneamente ridotto a seguito di crisi elettrografiche, una nozione nota come depressione post-critica25. In linea con i precedenti modelli di epilessia26, abbiamo trovato un periodo di riduzione della potenza EEG dopo le convulsioni. Durante questo periodo post-elettorale, l’energia EEG è stata ridotta del ~ 34% rispetto ai periodi pre-elettorali (vedere la figura supplementare S6).

Le convulsioni evocate non influiscono sul potere EEG a lungo termine
Abbiamo poi esaminato come diverse bande di frequenza siano state singolarmente modificate dal protocollo di accensione per decine di minuti a giorni (Figura complementare S7). Abbiamo scoperto che, dopo l’induzione (Fig. 1C), le potenze della banda delta e theta aumentavano di potenza per molte decine di minuti, mentre diminuivano le potenze della banda ondulata e delle ondulazioni rapide (Figura complementare S7). Tuttavia, questo effetto non si è protratto durante le sessioni di stimolazione: non è stata osservata alcuna variazione nella potenza di qualsiasi banda di frequenza quando si confronta il periodo di riferimento prima dell’induzione attraverso le sessioni (Figura complementare S7). Questo risultato era in contrasto con quello trovato con le risposte EEG evocate con luce laser (Fig. 5), che sono state modificate a lunghissimo termine, con cambiamenti che persistono attraverso le sessioni.

Presi insieme (Fig. 5, Figure integrative S6 e S7), i nostri risultati rivelano un complesso insieme di cambiamenti nelle dinamiche EEG intrinseche ed evocate, che agiscono su diverse scale temporali. Sebbene la depressione postittiva di EEG intrinseco sia stata seguita immediatamente dopo le convulsioni optogeneticamente indotte (Fig. S6 Supplementare), come precedentemente mostrato25,26, questo risultato dipendeva da quali bande di frequenza e su quali periodi di tempo sono stati analizzati (Figura complementare S7). Solo il secondo delle risposte EEG evocate dal laser è stato potenziato a lungo termine, persistendo in diverse sessioni (Figura 5).

Discussione

Optokindling e la classica accensione elettrica condividono le proprietà chiave
Basandoci sul classico modello di kindling1, abbiamo sviluppato un robusto metodo di attivazione optogenetica neocorticale dell’epilessia. Optokindling ha ricapitolato alcune caratteristiche essenziali della sua controparte classica4. Innanzitutto, la maggior parte degli animali ha sviluppato convulsioni, in linea con studi di accensione elettrica che mostrano uno sviluppo convulsivo robusto27,28. In secondo luogo, le convulsioni sono emerse gradualmente in diverse sessioni di stimolazione. Analogamente al potenziamento elettrico, optokindling richiedeva più di dieci sessioni prima del primo attacco e una ventina di sessioni per lo sviluppo di convulsioni generalizzate28,29. Sebbene alcuni rapporti classici mostrino convulsioni generalizzate prima della sessione dieci, vi è una considerevole variabilità da animale ad animale30. Questo è intrigante, dato che l’accensione elettrica stimola una popolazione di cellule più diversificata rispetto al nostro protocollo optoindicatore. Terzo, una volta che i sequestri iniziarono a verificarsi, aumentarono in gravità e durata tra le sessioni. Inoltre, il tempo di stimolazione del laser di soglia necessario per evocare le crisi è diminuito4, anche se non è stato determinato se ciò abbia comportato anche una riduzione della soglia extrafocale31. Infine, vi era una conservazione a lungo termine della suscettibilità delle convulsioni negli animali accesi. Dopo una pausa di 36 giorni nella stimolazione, le convulsioni sono state simili a quelle degli animali accesi, suggerendo che gli animali non si sono immediatamente “ripristinati” allo stato di malessere una volta interrotte le sessioni di stimolazione ripetute. Questi risultati sono coerenti con le precedenti relazioni sulle caratteristiche distintive del riscaldamento elettrico27,32,33.

Come prova di principio, abbiamo utilizzato il nostro modello optogenetico per dimostrare diversi risultati precedentemente trovati nei modelli di epilessia. Innanzitutto, abbiamo trovato prove del fatto che le oscillazioni ad alta frequenza precedono l’attività a bassa frequenza nei sequestri24. In secondo luogo, abbiamo osservato che la depressione post elettorale dell’EEG era associata a convulsioni, come mostrato in precedenza nella neocorteccia26. Infine, abbiamo scoperto che l’epilettogenesi era associata a un cambiamento graduale nella dinamica dell’EEG evocata, come precedentemente riscontrato nei potenziali di campo locali dell’ippocampo acceso.

Vantaggi dell’optokindling
Optokindling ha diversi vantaggi rispetto alla sua controparte elettrica classica. In primo luogo, le crisi convulsive si sono sviluppate in assenza di un grave danno cerebrale, fornendo un paradigma di epilettogenesi sperimentale con una maggiore specificità per la plasticità e per l’attività patologica. Nel presente studio, l’iniezione virale è stata scelta come metodo per limitare la popolazione di cellule che esprimono ChR2. Questo ci ha permesso di imitare più da vicino l’eziologia delle crisi focali che comporta il reclutamento iniziale di una rete più piccola di neuroni con conseguente diffusione dell’attività e peggioramento delle crisi. Sebbene l’iniezione virale iniziale abbia presumibilmente prodotto un certo grado di danno, non siamo stati in grado di rilevare dopo molte settimane. È importante sottolineare che le iniezioni di controllo AAV-EYFP non hanno provocato alcun animale con convulsioni. In futuro, le linee del mouse transgenico che esprimono ChR2 potrebbero essere utilizzate per eliminare qualsiasi lesione al cervello intatto. Inoltre, un numero diverso di cellule potrebbe essere progressivamente reclutato durante optokindling in linee di topo transgeniche che esprimono ChR2 per studiare diversi scenari di epilettogenesi dilatando o limitando l’area di illuminazione. La craniotomia può anche essere evitata completamente attivando ChR2 attraverso il cranio34,35. Anche se diversi studi di kindling classici non hanno riportato danni al tessuto lordo19, l’elettrodo di stimolazione cronica deve lasciare qualche danno mentre le fibre che abbiamo usato per optokindling non penetrano nel cervello.

In secondo luogo, optokindling consente il reclutamento mirato di tipo cellulare specifico. Questa è una caratteristica importante dal momento che la plasticità neuronale dipende dal tipo di sinapsi36, quindi si prevede che il kindling sia dipendente dal tipo di cellula. Infatti, è stato dimostrato che le convulsioni dirette optogeneticamente dipendono in modo critico dal tipo di cellula26. In altre parole, l’attivazione indiscriminata di diversi tipi di neuroni e fibre locali è un inconveniente del classico accenno elettrico, sebbene optokindling guidi indirettamente anche altri tipi di cellule. In futuro, chiarire la dipendenza del tipo di cellula nell’optokindling aiuterà a chiarire i meccanismi del circuito che sostengono l’epilettogenesi.

In terzo luogo, optokindling fornisce un mezzo per testare il modello a due colpi per quanto riguarda la lesione e l’infiammazione. Nella visione a due colpi sull’epilessia, è necessario un secondo agente per lo sviluppo spontaneo di crisi37. Tuttavia, è difficile esplorare il coinvolgimento dell’infiammazione e della lesione con l’accensione elettrica classica, poiché l’elettrodo di stimolazione introduce questi due fattori. Con l’optoindicazione, in assenza di craniotomia o infezione virale, l’infiammazione potrebbe essere sistematicamente aggiunta come secondo fattore per studiare come promuove l’epilettogenesi.

Limitazioni attuali di optokindling
Non è chiaro il motivo per cui le attese di convulsioni spontanee osservate nell’epilessia non vengano osservate con l’optoindagine. Tuttavia, è interessante notare che le convulsioni spontanee non sono state osservate con il classico accendino elettrico – a meno che l’animale non sia esagerato attraverso centinaia di sessioni15,16. Ciò può implicare che le convulsioni spontanee si sviluppano lentamente. In alternativa, il sovrasmegamento con il protocollo classico può contribuire a fattori aggiuntivi e possibilmente criticamente necessari, ad es. ferita o infiammazione19 (anche se vedi ref.38). Optokindling può fornire un controllo sperimentale migliorato adatto a indagare la questione fondamentale di ciò che è necessario per ottenere convulsioni spontanee.

Un’altra limitazione è che il nostro paradigma optogenetico richiede molto tempo. Per permetterci di monitorare l’emergere graduale dei sequestri, abbiamo intervallato le sessioni di stimolazione di due giorni. Siamo anche stati motivati dal timore che le sessioni di stimolazione distanziate troppo da vicino possano ridurre l’efficacia dell’epilettogenesi27,39. Sebbene questo approccio fornisse un’emergenza graduale delle crisi evocate, che era auspicabile per studiare l’epilettogenesi, il lungo ritardo tra le sedute richiedeva più di 50 giorni di stimolazione ripetuta, che non è l’ideale per molte applicazioni. Notiamo che questo avvertimento è essenzialmente condiviso con il classico modello di accensione elettrica. Abbiamo, tuttavia, ottimizzato l’optoindirizzamento usando un protocollo di induzione più forte per provocare crisi in meno di 5 giorni (McFarlan et al., CAN 2018 poster 1-G-144). Sono necessari ulteriori lavori per restringere lo spazio parametrico ideale per l’optokindling rapido.

Il ruolo della plasticità nell’epilettogenesi
Abbiamo dimostrato che a causa della ripetuta attivazione patologica di un piccolo cluster di PC nella corteccia motoria, i circuiti locali subiscono cambiamenti plastici che portano alla comparsa di convulsioni generalizzate. Questa plasticità del circuito sembrava accadere in assenza di danni al cervello e infiammazione, implicando la plasticità come agente causale chiave. Sebbene tutte le bande di frequenza EEG studiate non siano state influenzate da tutte le sessioni, abbiamo trovato alterazioni a lungo termine delle dinamiche EEG evocate, supportando inoltre l’interpretazione che la plasticità ha almeno parzialmente sostenuto i cambiamenti del circuito che promuovono le crisi. Tuttavia, poiché l’ampiezza iniziale delle risposte EEG evocate non è stata influenzata, questa non sembra essere una forma di plasticità Hebbiana2. Sebbene siamo stati ispirati dai protocolli LTP classici nel progettare il nostro protocollo optogenetico, il nostro studio non ha affrontato direttamente come l’Hebbian LTP correlasse all’epilettogenesi4,6, che avrebbe richiesto il test se l’accensione fosse occlusa successiva induzione LTP13,14. Abbiamo anche esplorato se l’optokindling fosse associato a cambiamenti nelle proprietà intrinseche del PC, ma non ne abbiamo trovati, coerenti con i rapporti precedenti40,41. Vi sono stati, tuttavia, cambiamenti marcati nella dinamica a breve termine delle risposte EEG evocate, che potrebbero essere dovute ad alterazioni della plasticità sinaptica a breve termine o alla riduzione del feedback inibitorio21. La plasticità è stata quindi collegata all’epilettogenesi nel nostro modello, anche se la natura specifica di questa plasticità rimane da scoprire. Questo collegamento è coerente con l’interpretazione di Goddard della prolungata suscettibilità ai sequestri come una forma di memoria nel modello di accensione originale1, poiché la plasticità è stata postulata per sottostare all’apprendimento2,3.

Direzioni future
Per quanto ne sappiamo, il nostro modello è il primo a utilizzare sistematicamente optogenetica per l’accensione neocorticale di animali che si comportano in modo sveglio e in buona salute. Uno studio recente sull’ippocampo ha dimostrato lo sviluppo graduale delle crisi utilizzando optogenetics42, ma non ha esplorato se l’elevata suscettibilità alle crisi fosse mantenuta a lungo termine come nel modello originale di accensione1, né era possibile valutare la componente comportamentale dal momento che i topi erano sedati . Sono stati anche condotti diversi studi sull’optogenetica per interrompere43,44,45,46 e iniziare le crisi nell’ippocampo47,48 e nella corteccia26,49. Sebbene questi studi abbiano dimostrato convulsioni optogeneticamente suscitate, non hanno mostrato accensioni, cioè una dimostrazione di entrambi i cambiamenti graduali nella soglia e nella gravità delle crisi, che è essenziale per fornire un collegamento alla plasticità. Inoltre, questi studi si basavano sulla stimolazione optogenetica sia in combinazione con modelli di induzione classica45,50 o con fenotipi di malattia preesistenti49, rendendo così difficile districare il ruolo della plasticità da quello di lesione e infiammazione nello sviluppo delle crisi. Tuttavia, con l’optokindling, è possibile isolare il ruolo distinto della plasticità nell’epilettogenesi.

Per riassumere, anche se l’accensione non modella tutte le varianti dell’epilessia ugualmente bene, è possibile optoindicando l’aggiramento di diverse limitazioni associate ad altri modelli di induzione delle crisi, per es. identità di cella sconosciuta e dimensione del cluster di celle. Studi futuri con optokindling possono esplorare i contributi specifici del tipo cellulare all’epilettogenesi, o la plasticità del microcircuito associata all’epilettogenesi, oltre ai ruoli di ferita e infiammazione nel modello a due colpi. A causa della sua attenzione più specifica sulla plasticità, riteniamo che l’optoindimazione sarà utile per trovare trattamenti terapeutici, per arrestare o rallentare la plasticità patologica nell’epilettogenesi.

Metodi

Etica
Tutte le procedure sono conformi agli standard e alle linee guida stabiliti dal Consiglio canadese per la cura degli animali (CCAC) e dal Comitato per la cura degli animali della struttura ospedaliera di Montreal (FACC), con gli appropriati protocolli approvati per l’uso animale. Per gli interventi chirurgici, gli animali sono stati anestetizzati con isoflurano (CDMV Inc., St-Hyacinthe, QC, Canada). Per il prelievo di fette acute, i topi sono stati anestetizzati con Avertin (Sigma Aldrich, Oakville, ON, Canada) o isoflurano e sacrificati una volta perso il riflesso di astinenza degli arti posteriori. Ogni tentativo è stato fatto per assicurare il minimo disagio degli animali.

Iniezioni virali stereotassiche e impianto di viti EEG
Abbiamo indirizzato il ChR2 alla corteccia motoria primaria (M1) dei topi maschi C57BL / 6 J in età postnatale (P) 30-45 usando iniezione stereotassica bilaterale di AAV-CaMKIIα-hChR2-E123T / T159C-p2A-EYFP (nucleo del virus UNC, Nord Carolina, USA), dal momento che due siti di accensione funzionano meglio di uno51. I maschi venivano scelti esclusivamente al posto delle femmine poiché il ciclo dell’estro può influenzare la suscettibilità alle convulsioni52. Il virus dai costrutti plasmidici di Karl Deisseroth è stato confezionato da UNC Vector Core in sierotipo 5 AAV. Usando un apparato stereotassico (solo per Mouse 5731, Stoelting Inc, Wood Dale, IL, USA), abbiamo iniettato 1,2 μl di virus bilateralmente, seguendo le procedure descritte in precedenza34. Le coordinate di iniezione relative al bregma erano di 1,1 mm antero-posteriore, 1,5 mm mediolaterale e 0,8 mm dorsoventrale. Successivamente abbiamo posizionato e cementato ghiere ceramiche da 1,25 mm (CFC-230, Thorlabs, Newton, NJ, USA) sopra la regione iniettata di ciascun emisfero alle stesse coordinate dell’iniezione. Le ghiere contenevano fibra multimodale da 0.37-NA del diametro di 200 μm per consentire la consegna della luce. In coincidenza con l’iniezione virale e il posizionamento della ghiera, abbiamo impiantato anche viti di registrazione e di messa a terra (filettatura da 1/8 “, 000-120, 90910A600, McMaster-Carr, Elmhurst, Illinois, USA), stabilizzate con cemento dentale (Lang Dental, Wheeling , IL, USA). Gli animali sono stati valutati per il corretto posizionamento con colorazione di proteina fluorescente gialla (EYFP) migliorata (vedi sotto). Le coordinate per le viti di registrazione tipicamente centrate intorno a ± 3 mm mediolaterale, -0,6 mm antero-posteriore mentre le viti di riferimento sono state poste a ± 3 mm ML e -4 mm AP. Le viti avevano un filo conduttore saldato e collegato a prese dorate (64-132, Warner Instruments, Hamden, CT, USA o 33 × 1880, Newark Electronics, Pointe Claire, QC, Canada) per registrazioni EEG. Abbiamo usato una vite di riferimento di terra separata per l’emisfero sinistro e destro.

Registrazioni in vivo e stimolazione optogenetica
Agli animali sono stati dati 21 giorni di tempo per riprendersi dall’intervento chirurgico, dopodiché sono stati abituati per tre giorni alla preparazione della registrazione prima di iniziare le sessioni di stimolazione. La gabbia di registrazione consisteva in un cilindro di plexiglas largo 30 cm di diametro e 40 cm di altezza ricoperto di rete di rame e con un fondo di rame. Per ridurre il rumore fungendo da gabbia di Faraday, la piastra di rame e la rete della gabbia erano collegate alla terra dello chassis dell’amplificatore. Due laser blu da 445 nm (Monopower-455-150-MM-TEC, Alphalas GmbH, Germania) su supporti cinematici per montanti V-clamp (C1513 / M, Thorlabs, Newton, NJ, USA) per facilità di allineamento, erano accoppiati ad aria (porta asferica FC / PC in fibra di vetro PAF-X-18-PC-A con staffa di montaggio HCP, Thorlabs, Newton, NJ, USA) a due cavi patch in fibra ottica lunghi due metri (M83L01, Thorlabs, Newton, NJ, USA), accoppiati a ghiere ceramiche montate bilateralmente da 1,25 mm (CFLC230-10, Thorlabs, Newton, NJ, USA). La ferrula impiantata non ha penetrato il cervello. La potenza luminosa in uscita dalla fibra era di 5 mW; è stato misurato prima e dopo ogni sessione di stimolazione per assicurarsi che rimanesse stabile. Gli EEG sono stati raccolti a 2-10 kHz con un amplificatore extracellulare (Modello 1700, AM Systems, Sequim, WA, USA) e sono stati digitalizzati su una scheda PCI-6221 (National Instruments, Austin, TX, USA) utilizzando software interno in esecuzione in Igor Pro 6.37 (Wavemetrics Inc., Lake Oswego, OR, USA) su un computer desktop (PC desktop Micro Tower SL-DK-H61MX-ID, SuperLogics, Natick, MA) con Windows XP SP7. Questo computer ha anche episodicamente TTL-gate i due laser a 445 nm. Il comportamento degli animali è stato registrato con due fotocamere, una sopra l’impostazione di registrazione e una a lato (webcam Logitech C525, Tiger Direct.ca Inc., Calgary, AB, Canada). Il video è stato acquisito utilizzando il software iSpy (versione 6.7.9, https://www.ispyconnect.com) in esecuzione sul computer di acquisizione EEG. Per valutare la gravità comportamentale delle crisi da questi video, abbiamo usato una scala Racine modificata (Tabella 1). Se il comportamento era a cavallo tra due stadi Racine, il punteggio è stato preso come valore intermedio, ad es. 4.5 se tra 4 e 5. Come forma di verifica, il punteggio di Racine è stato determinato indipendentemente dal rilevamento elettrostatico automatico delle crisi. Non abbiamo classificato il movimento della zampa a causa dell’attivazione optogenetica diretta come clono, poiché è una conseguenza banale e diretta dell’attivazione di programmi motori che non è correlata all’epilessia. Gli animali senza convulsioni hanno confermato di avere un’espressione virale mediante colorazione per EYFP e il corretto posizionamento è stato verificato con le risposte EEG dovute alla stimolazione della luce laser.

I topi venivano stimolati ogni due giorni con lo stesso protocollo della durata di ~ 33 minuti. Le sessioni di stimolazione sono state numerate in modo sequenziale a partire da uno. Ogni sessione consisteva in un periodo iniziale iniziale di 10 minuti, un’induzione lunga tre minuti e una seconda baseline lunga 20 minuti. La stimolazione di base consisteva in due impulsi laser da 445 nm a 10 ms erogati a 30 Hz ogni 10 secondi. Il periodo di induzione consisteva in cinque periodi di tre secondi di stimolazione a 50 Hz al 50% del ciclo di lavoro e tre secondi dell’intervallo di interruzione, ripetuto tre volte una volta al minuto (Figura 1). Abbiamo classificato le bande di frequenza come segue (ad es. Fig. S3 supplementare): delta (0-4 Hz), theta (4-8 Hz), alfa (8-12 Hz), beta (12-30 Hz), gamma (30- 80 Hz), increspature (80-250 Hz) e increspature veloci (250-500 Hz).

Abbiamo impiegato due tipi di animali di controllo. Nei controlli EYFP, l’EYFP da solo è stato espresso usando AAV5-CaMKIIα-EYFP (UNC Virus Core, North Carolina, USA), e la stimolazione durante la linea di base e l’induzione era come descritto sopra. Nei controlli ChR2, è stato espresso lo stesso costrutto ChR2 degli animali stimolati, ma la stimolazione a 50 Hz è stata omessa dal periodo di induzione; il modello di stimolazione di base era come sopra.

Nel riaccendere gli esperimenti, i topi non furono stimolati per 36 giorni dopo l’ultima delle prime 25 sessioni di accensione. Una volta ripresa la stimolazione, i topi venivano stimolati ogni due giorni, come prima. La prima sessione dopo la pausa di 36 giorni è stata considerata come riaccensione della prima sessione, con sessioni successive numerate sequenzialmente.

Articolo scritto su www.nature.com

Traduzione effettuata con Google Translation